荧光定量 PCR 疑难解析大本营（一）

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荧光定量 PCR 是分子生物学的强大工具，实时版通过荧光探针监测PCR反应，用于定量DNA或RNA。遇到的挑战主要集中在引物二聚体形成、引物和探针储存以及NTC扩增的控制上。以下是关键问题的概述：

1. 引物二聚体问题：

- 形成原因：当引物对间的序列相似时，可能导致二聚体，影响PCR效果。

- 验证方法：通过凝胶电泳检测，凝胶底部的扩散条带表示二聚体，但其敏感性有限。熔解曲线分析可提供更准确的判断。

- 解决策略：优化退火温度，降低引物浓度，调整镁离子浓度，考虑重新设计引物或使用热启动酶。

2. 引物和探针储存：

- 重要性：稳定的储存条件对长期实验结果至关重要。

- 稳定性保持：冷冻干燥的引物应在-20°C保存，避免标记物暴晒。使用适当浓度并分装，选择TE缓冲液。

3. NTC扩增：

- 污染迹象：NTC反应中的扩增表明可能存在试剂污染。

- 防治措施：保持工作台清洁，预混液降解前序反应产物，替换污染试剂，不同地点进行实验。

优化这些步骤能确保实时荧光定量PCR的准确性和可靠性，尽管初始设置可能耗时，但高质量的结果对科学研究至关重要。