荧光定量PCR(qPCR)问题汇总

Answer 1

1. 背景校正程序用于测量定量PCR仪所用反应管和水的空白荧光强度。在10分钟内，仪器连续读取背景校正板的荧光强度，温度为60°C。软件计算平均值，用于从实验数据中扣除背景信号。推荐每三个月到半年校正一次，以防因污染、反应板、水纯度变化等因素影响信号强度。

2. 实验可使用96孔光学反应板与膜、0.2ml光学八联反应管与膜、0.2ml光学八联反应管与盖。选择时需考虑兼容性与成本。

3. 磁盘碎片整理合并文件碎片，优化系统性能。在Windows下，右键点击硬盘，选择属性，工具，开始整理，执行碎片整理。

4. 除非有美国应用生物系统公司的通知，否则不要更新操作系统，以防SDS软件与新版本Windows操作系统冲突。

5. 定期备份实验数据，包括定量PCR仪的纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据。备份频率推荐每周一次。

6. 良好的实验室环境有助于延长仪器寿命，如配备UPS、稳压器，良好通风，控制温度在10-30°C，湿度20-80%，配备除湿机等。

7. 运行背景校正反应板或执行ROI校正，以检测污染。使用乙醇清洁污染的反应孔，吹打后吸去废液，重复清洗，确保残留液体蒸发。

8. 开机顺序：先开电脑，再开定量PCR仪主机，待绿灯亮后开启软件。关机顺序：关闭软件，关闭主机，最后关闭电脑。

9. 纯荧光校正是为了让仪器识别各种荧光染料。推荐每半年进行一次校正，以保持准确度。

10. 使用光学膜密封96孔板，正确方法是纵向压膜，然后横向，最后边缘按压。

11. 单管或8连管实验时，建议对称纵向放置样品，优先第6列或第7列，提高数据精确性。

12. 绝对定量测定基因数目，相对定量比较基因含量百分比，无需知道拷贝数。绝对定量需使用标准品，相对定量可使用标准曲线或CT值比较法。

13. 实验数据需进行参比信号、内对照和基准样品校正。内对照校正使不同样本数据可相互比较。

14. 目标是研究药物处理后基因表达变化，内对照是18S RNA基因。实验数据通过标准曲线或CT值比较法处理。

15. ROX荧光校正确保实验结果的精密与可靠。仪器收集信号必须归一化校正，消除物理因素波动。

16. 每个反应管的探针数目受限于仪器、软件、试剂、实验设计和成本控制。最佳组合为4-5种荧光。

17. 内标法与外标法数据精确度相同，内标法优点是反应条件一致，外标法避免了竞争与抑制问题。