荧光定量PCR的几个问题

Question

老师要求本人测定水稻抗旱相关的20多个基因的相对表达量，有四个样。太多了，而且样品有限。我没有测扩增效率，直接用双△法测表达量了。内参是用的UBQ5，一个印度人写的。现在遇到很多问题，用的是TAKARA的荧光定量试剂盒，
1、好几个基因CT值都大于35，我提高了模板浓度也不行（我没测RNA浓度，直接测cDNA浓度，然后调成与试剂盒要求的DNA的量来做）。
2、PCR反应过程都按照说明书上设置了，没改改动，循环数40个，因为不太会改。另外用primer5算出的温度，还是用Oligo6算出的温度？因为试剂盒说明书上只给出了Oligo6的温度范围。
3、我跑普通PCR的时候有时候没条带，但跑荧光的时候特异性很好。那是不是没必要跑普通PCR了呢？不过我听其他实验室人说，要先跑梯度PCR，找出最适退火温度，然后再上荧光PCR。
4、有时候有非特异性扩增，提高温度了还不行，是不是要换引物了？
不好意思，本人新手不太懂，折腾了好几千块钱了，还没出什么结果，很是焦急。求大神指导，不胜感激！！！

Answer 1

1. 最好是测下浓度，把cDNA模板调整到100ng/反应再试试，PCR的循环调整到45
2. primer5 和oligo6的温度不会差很多的，两个软件都算好了，然后-3度 跑PCR
3. 做普通PCR把循环数增大到45试试，可能是你的基因的表达丰度太低了
4. 非特异性扩增不一定是引物的问题，另一个原因可能是你扩增的基因同源基因比较多，或者你设计的引物刚好在保守的domain区域，这样的情况即便引物再好，也很容易能扩增出来其他的东西。

最后，不要心急，遇到问题一个一个解决，荧光定量做起来不是很难，但是还是需要一些经验，