双链RNA提取方法以及每一步的原理是什么

Answer 1

真菌菌丝的总RNA的提取
RNA提取缓冲液（CTAB）：2%
CTAB（W/V），2%
聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100
mM
Tris-HCl（pH8.0,DEPC处理的水配置），25mM
EDTA,
0.5g/L
亚精胺Spermidine，2.0M
NaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC
处理的水配制即可。
SSTE：1
M
NaCl，0.5%
SDS（W/V），10
mM
Tris-HCl
pH8.0，1.0
mM
EDTA
10M
LiCl
直接用蒸馏水配10M
LiCl，加1‰的DEPC过夜后，高温灭菌。
3M
NaAc
氯仿:异戊醇（24:1）
酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）
DEPC处理水
用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜，高温灭菌
无水乙醇
70%酒精
1.
实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热，离心管中加入ME（巯基乙醇）（10mL加80ul，50mL中加入300ul）。
2.取约0.8g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了），在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50
mL离心管，按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液，颠倒混匀。
3.
65℃水浴3-10
min，期间混匀2-3次
4.
加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提（10,000
rpm，4℃，5
min）
5.
取上清，等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提（10,000
rpm，4℃，5
min）
6.
加入1/4V体积10M
LiCl溶液，4℃放置6hr以上(或过夜)
7.
10,000
rpm，4℃离心20
min
8.
弃上清，用500
ulSSTE溶解沉淀
9.
酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次,
氯仿:异戊醇（24:1）抽提1次（10,000
rpm，4℃，5
min）
10.
加2V体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30
min以上
11.
12,000
rpm，4℃离心20
min
12.
弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥
13.
加200
ul的DEPC处理水溶解
14.
用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
（在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数）
注意：提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。