实时荧光定量PCR的结果该怎样分析？

Question

为什么最好不用Syber Green？

Answer 1

1、如果有标准曲线，按照标准曲线计算；

2、一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算；

3、引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；

4、模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；

5、看CT值是分析荧光定量PCR最直观的一个数据，CT值一般在35左右就失去参考价值了，平时我们实验室用BIODAI-PCR荧光定量法测得的扩增曲线的起跳值基本在30左右。

扩展资料：

PVR的循环参数：

1、预变性；

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，加热时间参考试剂说明书。

2、变性步骤；

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

3、引物退火；

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4、引物延伸；

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5、循环数；

大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

6、最后延伸；

在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

参考资料来源：百度百科—实时荧光定量PCR

Answer 2

如果有标准曲线，按照标准曲线计算。

一般都是相对量，则用delta delta CT方法来计算。举例如下：对照组基因A的CT值为20， 内参：比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。

如果是realtime做表达量，用excel的制图，将每个个体的Ct值平均数做出柱状图就可以了。如你还做了标曲，就用制图中的散点图看R2值。其实这些功能做定量PCR的时候电脑程序应该会自动分析才对，具体情况具体分析。

技术原理

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

以上内容参考：百度百科-实时荧光定量PCR

Answer 3

如果有标准曲线，按照标准曲线计算。
一般都是相对量。则用delta delta CT方法来计算。举例如下：
对照组基因A的CT值为20， 内参（比如βactin)CT值15。实验组基因A CT值18，内参CT值14。
首先算加样量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。

几点注意：
1。必须确定扩增的特异性
2。 只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同）
3。 2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2。
4。 最好不用Syber Green

Answer 4

用2-△△ ct法算的话，应如何算？ 假设检测A基因，CT分别为（这里记住CT越大，表明相对含量越低） 普通组/Test1：28 实验组1/Test2：29 实验组2/Test3：30 这时候要设对照了，假设Test1为对照组（普通组），当然是以普通组为对照 那么，相对含量为。

Answer 5

看CT值、起始拷贝数、标准偏差等

如果是SYBR做的话，再看下溶解曲线