简述转基因的基本流程

Answer 1

第一步：获取目的基因
1. 目的基因是指编码蛋白质的结构基因。
2. 原核基因通过直接分离获得，真核基因则通过人工合成。人工合成目的基因常用反转录法和化学合成法。
3. PCR技术用于扩增目的基因，其原理是DNA双链复制。过程包括三个步骤：加热至90～95℃使DNA解链，冷却到55～60℃使引物结合到互补DNA链，加热至70～75℃使热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步：构建基因表达载体
1. 基因表达载体的构建旨在使目的基因在受体细胞中稳定存在并表达。
2. 载体由目的基因、启动子、终止子和标记基因组成。启动子是RNA聚合酶识别的部位，终止子位于基因尾端，标记基因用于筛选含有目的基因的细胞。
第三步：导入目的基因至受体细胞
1. 转化是目的基因进入受体细胞并稳定表达的过程。
2. 导入方法根据受体细胞类型不同而异。植物细胞常用农杆菌转化法，动物细胞常用显微注射技术，微生物细胞则常用Ca2+处理法。
3. 筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因的表达。
第四步：检测目的基因的表达
1. 检测转基因生物染色体DNA上是否插入目的基因，使用DNA分子杂交技术。
2. 检测目的基因是否转录出mRNA，采用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
3. 检测目的基因是否翻译成蛋白质，从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。
4. 必要时进行个体生物学水平的鉴定。
补充：基因工程工具
1. 限制性核酸内切酶（限制酶）来源于原核生物，能识别特定核苷酸序列并断开磷酸二酯键，具有专一性。
2. DNA连接酶连接DNA片段末端，E•coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶都能缝合磷酸二酯键，但后者连接平末端的效率较低。
3. 载体是基因工程中用于携带外源DNA片段的工具，常用的载体是质粒，具有自我复制能力和限制酶切点。详情