在结束相模方面的忧患后，元龟三年（1572）织田信长转战各地攻击反对势力，双方渐渐陷于精疲力竭的状态，本愿寺要求信玄打击信长同盟家康的势力。10月3日应与织田信长敌对的将军足利义昭之请，信玄从甲府领起兵三万余上京，目标直指京都，讨伐织田信长，获取天皇册封以号令天下。大军以山县昌景为先锋，出兵时信玄一度感到不适，为抓住机会，大军继续进发。武田胜赖攻破远江二俣城，山县昌景也陆续攻略东三河诸城。别队秋山信友攻破美浓岩村城。12月22日武田军主力与德川织田联军在三方原交战，双方一度胶着，随后织田的援军部队被武田骑马队突破，全军总崩。家康虽逃得性命，已无力阻挡武田军。第二年乘胜前进陆续攻破三河诸城，信玄方面虽然越后朝仓氏未按约出兵，但信长方面也没得到上杉的援助，然而在即将展开与信长一决雌雄的大战时，信玄肺痨病突然恶化（传说是脑溢血，一说受重伤）而不得不暂停上京计划，武田军被迫经信浓归阵.次年天正元年(1573)4月12日武田信玄殁于信浓的驹场，时年仅53岁，根据信玄的遗言，三年秘不发丧，而由信玄之弟信廉充任影武者。天正四年，信玄的遗体才正式下葬于惠林寺，信玄未能完成统一大业，一生努力和梦想最后成了一场空。据说得知信玄之死，上杉谦信也感到很悲伤，决心不再与甲斐作战。武田信玄死后仅两年，其子武田胜赖在长筱之战中惨败于德川织田联军，武田家走向衰落。1582年，在织田和德川的进攻下，胜赖与儿子武田信胜在天目山自杀，武田家灭亡。
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