怎样进行组织培养育苗？

Answer 1

（1）外植体的选择。外植体是指从植物体上切取下来，用于组织培养的部分，如顶芽、茎尖、侧芽、花器、鳞片等。一般说来带芽的外植体如茎尖和侧芽等，它们产生幼苗的成功率高，而且很少发生变异，容易保持材料的优良特性。由分化组织构成的外植体，如茎段、叶、根、花茎、花瓣、花萼、胚珠、果实、花粉等，它们大多由已分化的细胞组成，由它们再生成幼苗，要有一个从分化状态回复到分生组织状态的脱分化过程，由这类外植体接种的材料，常常要经过愈伤组织阶段再分化出芽或胚状体而形成幼苗，形成的后代可能有变异。
（2）外植体的灭菌。取得外植体后必须进行严格的灭菌，这是因为外植体常常附有多种多样的微生物，这些微生物一旦被带进培养基，就会迅速滋生，使组织培养前功尽弃。在将各种微生物杀死或清除的同时，必须保持外植体的生活力。
先用流动的自来水冲洗10～20分钟，脏的外植体用洗衣粉洗涤，或用毛刷、毛笔轻轻刷洗，去掉污物，冲洗后用滤纸吸干外植体的表面水分。在70%的酒精里浸泡15～30秒钟，用无菌水冲洗两次。然后用适当的药剂消毒，经常使用的灭菌剂有次氯酸钠、过氧化氢、漂白粉和低浓度的氯化汞等。使用这些灭菌剂，都能起到表面杀菌的作用。具体使用的浓度和浸泡的时间因外植体的种类和药剂而定。如用2%～10%次氯酸钠水溶液浸泡3～15分钟。灭菌后立即用无菌水冲洗3～5次，洗去药液，用无菌滤纸吸干水分，准备分离。
（3）外植体的分离。在超净工作台上进行分离。提前15～20分钟开机，并用70%的酒精擦拭台面。点燃酒精灯用于工具的消毒。如果使用的外植体太小操作困难，可在解剖镜下进行。外植体小的用大头针将其固定在橡皮塞上，然后在解剖镜下分离切取。用无菌刀、剪、镊子等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮等，叶片不需剥皮。然后切成0.2～0.5厘米厚的小片，就可以植入培养基了。在操作过程中严禁用手触动材料。
（4）外植体的植入。在超净工作台上打开装有培养基的瓶或试管。在酒精灯的火焰上烤一下瓶口或试管口，再开启瓶盖。在无菌环境下，将切好的外植体立即接在培养基上，组织培养育苗最常用的培养基为MS。每瓶接种4～10个。再在火焰上烤一下瓶和瓶盖。接种后，立即盖上瓶盖，试管用无菌药棉塞上。及时写好记录，贴上标签。
（5）诱导。消毒后的外植体在诱导培养基上培养一段时间后可诱导出丛芽、胚状体、原球茎、根状茎，我们将这些培养材料称为中间繁殖体。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，组织培养育苗是必须使用的。最常用的为6-苄基腺嘌呤，常用浓度为1～2毫克/千克。萘乙酸、吲哚丁酸、吲哚乙酸。后3种药剂既在配制生根培养基时应用，又常在诱导、增殖和壮苗时使用。
（6）中间繁殖体的增殖。对中间繁殖体进行切割、继代培养就可以进行中间繁殖体的增殖。中间繁殖体的增殖速度随花卉的种类、培养基、培养条件的不同而异，因而对具体花卉需进行试验，找到合适的繁殖条件。当中间繁殖体增殖到一定数量后快速繁殖进入生芽、壮苗和生根阶段。如果是通过丛芽繁殖，则不需经过生芽直接进行壮苗、生根，如果是通过其他途径则需先将中间繁殖体转移到生芽培养基上，然后再转移到壮苗生根培养基上。在壮苗生根培养基上，大多数花卉要分离成单苗。
（7）生根。继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，要促使试管苗生根，必须转移到生根培养基上，生根培养基常用1/2MS培养基，无机盐浓度低有利于根的分化。同时，不同花卉诱导生根时所需要的生长素的种类和浓度是不同的，常用生长素萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸。一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得健壮根系。
（8）试管苗移栽。对已经生根的试管苗及时移栽是组织培养育苗的最后工作。由于组织培养苗是在无菌、有营养供给、适合光照、温度和100%相对湿度环境中生长的，因而刚出瓶的试管苗对外界环境不太适应，稍有不慎就会造成大量死苗。出瓶前1～3天打开瓶盖，让幼苗锻炼，适应外部不良环境和对病菌的适应能力，但不能太早，以免培养基生长霉菌。对刚出瓶的组织培养苗要细心管理，控制适当的温度、弱光照、较高的空气湿度、适宜的基质及对病虫害的有效控制。
（9）操作过程注意事项。在整个操作过程中，工作人员必须用肥皂和流动的自来水把手洗干净，带上口罩、帽子，穿上工作服，接种前双手用70%的酒精擦拭，工作时不说话。

Answer 2

专家解答

组织培养繁殖法是利用细胞的全能性和组织的再生能力，切取草莓植株的部分组织或器官，在无菌条件下，接种到人工配置的培养基上，使之发育成完整的植株。草莓组织培养繁殖的优点是：

（1）植株健壮结果好任何植物在长期的无性繁殖过程中都容易感染病毒，受到病毒感染的植株生活力衰退，产量降低，品质变劣。而组织培养繁殖的整个过程是在无菌环境中进行的，对于做繁殖材料的茎尖也要进行脱毒处理，这样所得的秧苗不含或少含病毒，比一般秧苗叶片大而厚，叶色浓绿；生长健壮且整齐一致；结果期延长3周，平均增产20%左右；果个大，品质优。

（2）繁殖速度快利用组织培养法繁殖草莓，一年内一个分生组织可获得几千株甚至几万株秧苗，这种繁殖方法对加速新品种推广，特别是对抽生匍匐茎低的品种的繁殖更为有利。

（3）繁殖不受季节限制组织培养是在操作室和配套温室中进行的，不受外界环境条件的影响，一年四季均可生产，在人工控制条件下，可进行工厂化育苗。

（4）节省土地，利于种质保存用组织培养法繁殖是在实验室中进行的，对露地占用少。所以，不仅节省土地，便于管理，而且对保存种质资源更加安全。

组织培养繁殖有以下几个步骤：

（1）配制培养基常用的培养基是MS培养基、怀特培养基，其配方见表11。

①配制母液。将营养成分中大量元素扩大10倍，微量元素扩大100倍。把大量元素、微量元素、有机生长物质分别贴上标签，放在3～5℃环境中待用。植物生长调节剂如6-苄基嘌呤、激动素用少量0.5摩尔/升的盐酸溶解，萘乙酸用酒精溶解，溶解后加水稀释。

②培养基配制。将所要用的琼脂加热溶解，加入蔗糖搅拌，配制成琼脂-蔗糖液。然后按量把配制好的母液置入准备好的容器中，接着把琼脂-蔗糖液也置入同一容器中，充分搅拌，定容到规定的体积。

③调整酸碱度。琼脂培养基加热灭菌时，pH会降低0.1～0.3，所以在加热前用0.1摩尔/升的盐酸或氢氧化钠液调整培养基的pH。

④高温消毒。把培养基趁热注入试管或三角瓶内，注入量为容器容积的1/3左右，塞上棉塞，缚紧，放入高压蒸汽锅内灭菌。蒸汽锅压力维持在78.5～98千帕，时间为10～20分钟。

单位：毫克/升序号化合物MSWhite1硝酸钾（KNO3）1900802硝酸铵（NH4NO3）1650-3四水硝酸钙[Ca（NO3）2·4H2O]-3004硫酸钠（Na2SO4）-2005七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）3707206七水磷酸二氢钠（NaH2PO4·7H2O）-16.57磷酸二氢钾（KH2PO4）170-8氯化钾（KCl）-659一水氯化钾（KCl·H2O）440-10四水硫酸锰（MnSO4·4H2O）22.37.011七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）8.63.0表11营养基配方序号化合物MSWhite12硫酸铁[Fe2（SO4）3]-2.513五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.0250.00114氧化钼（MoO3）-0.00115硼酸（H3PO3）6.21.516碘化钾（KI）0.830.7517六水氯化亚钴（CoCl2·6H2O）0.025-18二水钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）0.25-19肌醇10010020烟酸0.50.321盐酸硫胺素0.40.122盐酸吡哆醇0.50.123甘氨酸2.0324蔗糖300002000025琼脂100001000026pH5.85.6表11营养基配方（续）-1（2）选材与消毒选取健壮植株上充实、小叶尚未展开的匍匐茎先端3厘米左右的幼嫩组织作培养材料。将材料用洁净流动的清水冲洗0.5～1个小时，然后用70%的酒精浸泡1分钟，再用0.1%升汞水浸泡7分钟，最后用无菌水冲洗2～3次。

（3）接种在无菌的超净工作台上，用镊子去掉茎尖组织的叶片，在解剖镜下，用消过毒的刀片切取茎尖分生组织0.3～0.5毫米大小，放入备用的培养基上。

（4）初代培养将接过种的试管或三角瓶放置在温度25～28℃，光照强度2000勒克斯，每天照射10小时的无菌条件下进行培养。10～15天接种物开始萌发，再经7～10天接种物产生很多小芽，形成芽丛；3个月后，无根苗长至3～4厘米。这时初代培养结束。

（5）继代培养当初代培养的无根苗长到3～4厘米时，将其取出进行生根培养。把剩下没达到3～4厘米的芽，按3～4个芽为一个芽丛重新分开，再重新植入同种培养基（初代培养基）上进行增殖培养，这种增殖培养称继代培养。1个月左右新的一批无根苗又繁殖出来，再用同种方法进行下一次继代培养。

（6）生根培养将初代培养或继代培养的高度已达到3～4厘米的无根苗，扦插到珍珠岩内进行生根培养。生根培养的苗床温度保持在18～20℃，空气湿度在80%以上，珍珠岩中要喷洒营养液和生根素。20天以后，当秧苗长出3～4条，长度达1.5～2.5厘米的根系时，可进行移栽锻炼。目前国内比较常用的营养液配方见表12。

化合物名称园试配方化合物用量毫克/升毫摩/升元素含量（毫克/升）大量元素总计（毫克/升）Ca（NO3）29454N112Ca160KNO38098N112K312NH4H2PO41534N18.7P41MgSO4.7H2O4932Mg48S64Na2Fe-EDTA20-Fe2.8H3BO32.86-B0.5MnSO4·4H2O2.13-Mn0.05ZnSO4·7H2O0.22-Zn0.05CuSO4·5H2O0.08-Cu0.02（NH4）6Mo7O24·4H2O0.02-Mo0.01N243P41K312Ca160Mg48S64表12营养液配方注：参引2001年张福墁主编《设施园艺学》。

（7）移栽当秧苗已长出3～4条1.5～2.5厘米长新根时，可移栽到室外进行土壤育苗。移栽后的前两周应覆盖薄膜与覆盖遮阳网，保持土壤和空气湿度，缓苗后撤除覆盖物。

提示板

组织培养能培育优质的壮苗，但技术要求比较严谨，目前还只在科研院所进行。随着科技的进步，大型繁育场将逐步得到推广。无毒育苗将是草莓苗木繁育的主要手段。

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