再生障碍性贫血发病机制是什么？

Answer 1

再生障碍性贫血（简称再障，AA）是一组由化学、物理、生物因素及不明原因引起的以骨髓造血衰竭和外周全血细胞减少为特征的疾病，其发病机制具有异质性，一般认为与造血干/祖细胞内在缺陷，造血微环境支持功能缺陷，异常免疫反应损伤造血干/祖细胞有关，但至今仍无较全面的阐明。现在，越来越多的临床和实验室证据表明，大多数再障的发病与免疫反应有关，而免疫抑制剂治疗再障有效，为上述论点提供了更为直接的证据。所以，再障的免疫机制研究已成为目前研究的热点，并取得了很大的进展，现综述如下。

1、T淋巴细胞数量和亚群的变化

多数研究表明再障患者外周血CD8+T淋巴细胞所占的比例增高，CD4+T淋巴细胞的比例减少，CD4+/CD8+比值降低；对再障患者骨髓和外周血的T淋巴细胞进行克隆培养，结果表明其骨髓和外周血CD8+细胞克隆明显高于正常人，表达CD25、HLA-DR、CD56+的细胞增多[1]。再障中细胞因子异常高度提示再障的Th1/Tc1细胞反应优势。Th1/Th2比例在再障循环淋巴细胞中显著升高[2]。T淋巴细胞识别抗原肽是MHC限制性的，HLA-DR2与发病有关，AA患者HLA-DR2的阳性率明显高于正常人群[3]，表达HLA-DR2的再障患者对CSA有较好的疗效。

2、T淋巴细胞受体(TCR)的表达状态

TCR属免疫球蛋白超家族，TCRβ链可变区由V、J和D基因编码。V区远端、D区和J区近端构成TCRβ链可变区基因片段的CDR3区。不同T细胞克隆具有不同长度或不同序列的TCR CDR3基因，形成多样性的TCRVβ CDR3基因谱型，从而决定TCR的特异性。Manz等[4]用RT-PCR法研究了AA患者骨髓及外周血TCRβ链上的Vβ1-Vβ 24转录表达后发现，再障患者存在TCRVβ基因的高度异质性表达格局，除Vβ10，Vβ11，Vβ12，Vβ18，Vβ19，Vβ20，Vβ22等基因外，其余家族的Vβ基因均有不同强度的表达，且表达产物的强度比对照普遍增高，其中某些亚家族在AA患者中的表达与正常对照比较，至少增加3倍以上，以上结果从分子生物学方面提示AA患者有特异的、针对某些特定抗原的寡克隆T淋巴细胞的增殖。而用VβPCR产物标记荧光素后，分别进行片段长度扫描，正常对照大都表现为均匀的多峰图形，T细胞谱是随机多样的，并不存在寡克隆T细胞的优势扩增；而患者的Vβ3, Vβ8, Vβ23产物的CDR3长度峰形图为主峰图，提示取用了Vβ3、Vβ8、Vβ23等基因的T细胞克隆，在某些因素作用下发生了寡克隆性扩张，表达这些Vβ基因的T细胞在患者骨髓中为优势扩增克隆。Lu等研究了肝炎相关性再障肝内淋巴细胞TCRVβ亚族，7例中6例被检测的Vβ21呈明显的偏态分布，其偏态分布程度同病毒性肝炎患者相似，而其外周血淋巴细胞TCR Vβ偏态分布的程度明显高于健康对照，免疫抑制治疗后，趋向于正态分布。有学者分析了AA患者骨髓中TCR的多态性，也发现骨髓中存在着由于抗原刺激而异常扩增的寡克隆淋巴细胞，并分析其TCR表达情况，发现绝大多数CD4克隆表达Vβ5，而CD8克隆表达Vβ13，并检测到大多数CD4克隆中存在互补决定区CDR3的序列，但正常对照中不存在；CD4克隆表现出Th细胞分泌方式，溶解自体CD34细胞，抑制造血克隆形成，免疫抑制治疗后带有CDR3 βV5克隆T细胞明显减少，进一步支持了部分再障患者T淋巴细胞可能被某一抗原激活后增殖，并识别具有该抗原表达的造血细胞而发生的自体免疫反应导致骨髓衰竭。

3、共刺激信号的变化

T-细胞激活需要两个不同的信号，第一信号为TCR，第二信号为T细胞上的另一受体与其配体，即共刺激信号。CD28是组成性表达于T细胞表面最重要的共刺激分子之一，T淋巴细胞单独接受TCR刺激不能被充分激活，并可导致失活或进入程序死亡，但同时激活CD28可充分激活T淋巴细胞；CD28与APC上的CD80（B7-1）、CD86（B7-2）互为配受体，结合后能大大增强CD3/TCR复合物激活T细胞的能力，并增强了T细胞分泌细胞因子的功能，诱导IL-2、IL-4、IL-5、GM-CSF等细胞因子的分泌，调节Th1/Th2细胞的分化和增殖能力，以及细胞周期的进行和对凋亡的敏感性[8]。检测AA患者外周血淋巴细胞共刺激信号CD28及其配体CD80和CD86的表达，结果SAA患者外周血CD4+/CD28+、 CD8+/CD28-T细胞与正常对照比较明显升高；免疫抑制剂治疗有效者CD8+/CD28-T细胞表达降低；CAA患者外周血CD8+/CD28-T细胞较正常对照升高[9]。CD28/B7共刺激信号增加IL-2转录及其mRNA的稳定性，而IL-2是T细胞的关键生长因子，IL-2分泌的增加促使CD4+细胞分化为Th1表型。CD4+/CD28+T细胞激活后通过促进IL-2分泌、促进Th1表型分化促进Th1因子的分泌增加，从而在AA发病中起一定的作用。

4、 AA患者T淋巴细胞的凋亡状态

Fas与其配体结合后能引起细胞内一系列凋亡效应分子活化，从而介导细胞凋亡，途径如下： Kim等研究发现由于Fas系统的缺陷导致Fas及FasL相互作用介导的活化诱导的细胞死亡，AICD异常，活化的淋巴细胞死亡数减少，参与AA免疫病理过程。Brazil等发现再障患者与正常人细胞中Fas抗原均有表达，但再障患者CD34+ 细胞的Fas抗原CD95表达明显高于正常人。再障患者T淋巴细胞高分泌IFN- γ和TNF- α等，此二者可诱导CD34+细胞Fas抗原的高表达，通过Fas与FasL相结合，诱导骨髓CD34十细胞大量凋亡，从而导致骨髓造血功能衰竭。国外学者测量了对照、AA、AA完全缓解和多次输血而非AA患者的外周血和骨髓CD3和CD19淋巴细胞的Fas受体(FasR)发现， AA患者外周血和骨髓的T和B淋巴细胞的FasR过高表达，但AA完全缓解者或多次输血的其它血液系统疾病患者并无此类异常。AA患者CD3/FasR细胞未增加，其淋巴细胞的FasR的交链引起凋亡信息的增加，但正常对照、完全缓解的AA患者或多次输血而非AA患者的淋巴细胞FasR的交链引起凋亡信息并不增加。认为AA患者的CD34+细胞、T、B淋巴细胞表面的Fas过度表达是AA的特点，AA患者细胞凋亡主要通过Fas和FasL。Liu等用PCR方法设计了一段能在质粒中表达的siRNA片段，这一片段能有效阻碍Fas在哺乳动物细胞的表达，结果导致细胞凋亡的减少，这一实验为进一步研究运用Fas抑制剂治疗再障等疾病奠定了基础。

5、 细胞因子异常在AA发病中的作用

AA患者由于T淋巴细胞亚群及功能的变化，淋巴因子的分泌失调，可产生过量的造血负调节因子，从而表现出明显的抑制活性。研究表明AA患者骨髓T淋巴细胞在体外不经预先刺激即可自发产生IFN-γ 、IL-2、TNF-α、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α、Skil等造血负控因子。

5.1 白细胞介素-2(IL-2)IL-2主要由活化T细胞产生，为T细胞增殖所必需，可诱导和增强NK细胞和CTL细胞的效应。IL-2产生的水平可反映T细胞的功能，用rh IL-2体外能够抑制造血干细胞增殖，再障患者血清及单个核细胞培养上清中IL-2水平升高，且部分患者单个核细胞可自发产生IL-2，说明IL-2异常与再障的造血抑制有关。最近有学者用抗IL-2受体的单抗治疗轻型再障患者取得了良好的效果，治疗16例患者6例有治疗反应，其中有2例血像完全恢复，4例血象有一系升高，2例输血依赖的患者可以不再输血，1例中性粒细胞减少反复感染的患者，中性粒细胞恢复正常；而最近Sloang等利用抗IL-2受体抗体（daclizumab）治疗纯红细胞贫血，15例患者中6例（40）在90天内对治疗有反应，而所有的患者在治疗18月后血红蛋白恢复正常水平[14]，这又为IL-2参与了再障造血抑制过程提供了直接的依据。

5.2 IFN-γ及TNF-αIFN-γ属于ΙΙ型干扰素，对粒系、红系、巨核细胞系、多能干细胞以及B细胞均有抑制作用。IFN-γ抑制造血的主要机制之一是通过触发凋亡系统，IFN-γ和/或TNF-α与造血细胞培养数天后，整个骨髓细胞及CD34+细胞发生凋亡。凝胶电泳出现典型的DNA降解改变“梯形”DNA以及原位末端脱氧核苷酰转移酶法可见到大量凋亡细胞，其原因是IFN-γ可上调细胞膜表面Fas受体的表达。将IFN-γ基因导入正常骨髓基质细胞中，使其持续分泌低浓度IFN-γ，5周后评价BFU-E和CFU-GM的产率，均低于对照组；而外加该浓度的IFN-γ不能对CD34+细胞产生抑制作用，若要达到同样抑制作用，外加IFN-γ浓度需高达内生性IFN-γ浓度100倍以上才行。这些事实说明T细胞通过其分泌的细胞因子抑制骨髓细胞的生长:骨髓局部高浓度抑制性细胞因子与AA的发病有关，而当造血抑制因子在造血干祖细胞旁近作用时，很低水平就能够起到显著效应。Young等采用基因转移技术在小鼠体内获得高表达IFN-γ的动物模型，转基因鼠表现出骨髓、脾、淋巴结内的B细胞及骨髓细胞系祖细胞的数量显著减少。IFN-γ在转基因鼠体内刺激T细胞增殖，增殖的T细胞又会再分泌IFN-γ，形成负性循环，从而抑制造血。IFN-γ可以激活靶细胞中许多信号转导通路，IFN-γ、TNF-α能在CD34+细胞中诱导NO合成酶表达，而NO对于CD34+细胞是有毒性作用的；IFN-γ还可以通过诱导转录因子―IFN调节因子-1而对造血起到抑制作用。体外实验表明IFN-γ和TNF-α能抑制造血干/祖细胞在组织培养中增殖，而TNF-α可以协调IFN-γ起作用，在体外培养的骨髓细胞中加入抗TNF-α抗体可以增加BFU-E和CFU-E的大小和数量。

6、 骨髓间充质干细胞与AA

骨髓间充质干细胞（MSC）可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞等， 研究认为MSC在体内外都具有免疫抑制的作用[19]。在主要组织相容性抗原（MHC）大部分不相配的小鼠模型实验中，给小鼠以致死剂量的放射线后，这些小鼠或骨髓移植失败，或死于移植物抗宿主病；然而，如果在供体骨髓中加入等量的供体成骨细胞，则100的骨髓移植物在上述小鼠模型体内成功生长，包括血细胞的再生和免疫机制方面的恢复，且并未产生移植物抗宿主病，从这一现象推测正常骨髓来源的间充质干细胞具有抑制T细胞活性的功能，并且为骨髓造血干细胞提供了一个具有免疫保护作用的微环境，从而使等位基因移植成功。MSC在体外同样具有免疫抑制作用，在实验中加入MSC可使T淋巴细胞活性下降。

最近发现，在 MSC和树突状细胞、NK细胞和T细胞相互作用后可产生前列腺素E2，可使免疫系统上调IL-4和IL-10的量，下调INF和TNF的量。Bartholomew收集了19例健康骨髓，23例患者（其中刚诊断为再障者3人，经过免疫抑制治疗者16人，13人免疫治疗有效无需输血维持，2人复发需输血治疗，1人免疫治疗无效，4例已经进行骨髓移植），分选出MSC后在体外培养，经过3次传代后用流式细胞仪鉴定再障患者和正常对照细胞表面标志，结果二者MSC的表面标志无显著差异；为了了解其二者是否在抑制T细胞活性方面有差异，他们把植物血凝素加入T细胞系中，72小时后加入培养的正常对照者的MSC，发现由植物血凝素诱导的T淋巴细胞增殖被抑制，并且与加入的MSC的量呈正相关；而在T淋巴细胞中加入再障患者MSC，其抑制T淋巴细胞增殖的能力却大大减弱，但骨髓移植患者MSC对T淋巴细胞增殖的抑制作用却恢复了。检测二者上清液中T淋巴细胞分泌的γ-IFN的量，加入正常对照者MSC后的T淋巴细胞产生γ-IFN的量显著减少，而加入再障者MSC的T细胞分泌γ-IFN的量却未见减少，经过骨髓移植的患者γ-IFN量减少；同时检测T细胞CD38的表达，T细胞中加入植物血凝素并和正常MSC共同培养，T细胞CD38的表达明显减少；在T细胞同再障患者（无论免疫治疗有效或无效）MSC共培养体系中，T细胞CD38表达却几乎不受影响。由此Bartholomew等推测正常MSC可释放2，3-二氧化酶吲哚胺（IDO），它是抑制T细胞活性的主要物质，而来源于再障患者的MSC缺乏抑制T细胞增殖和细胞因子释放的能力，因此无论是其中刚诊断为再障者、经过免疫抑制治疗者、免疫治疗有效者，复发需输血治疗者或免疫治疗无效者，其抑制T细胞增殖和活性的能力即使经过免疫抑制治疗数年后仍然低下。

7、展望

基于以上研究结果，我们认为再障的是一种自身免疫性疾病，其发病机制是多种免疫学机制相互作用的结果。在研究过程中有大量的现象及发病机制尚未得到阐明：如AA患者体内激活的T淋巴细胞增多，是否与T淋巴细胞未能及时、有效地凋亡有关? AA患者CD28的表达是否异常，体内、体外应用ATG+CSA后CD28表达如何变化及其可能的机制是什么？再长患者骨髓间充质干细胞的体外培养的结果是否能等同于体内骨髓微环境，毕竟体内环境是一个多种因素共同作用的结果，其抑制T细胞活性和增殖能力的确切机制目前尚不清楚。深入研究AA患者的T淋巴细胞及其各亚型的异常表现、机制及成因，骨髓间充质干细胞对AA患者造血干细胞的影响，对系统阐明AA免疫病理机制并进而指导临床治疗均具有重要意义。